Phương pháp Real Time PCR với kit iiQ-POCKIT

Trong bài viết này, HappyVet sẽ hướng dẫn phương pháp Real Time PCR với kit iiQ-POCKIT cho bạn đọc ứng dụng một cách chính xác nhất. 

Chuẩn bị mẫu

- Heo:  Mẫu máu hoặc mẫu mô tùy vào từng bệnh và sự phân bố của virus trong từng cơ quan.

- Gà: Swab khí quản hoặc mẫu mô.

Các lưu ý khi bảo quản:

- Đối với tất cả các mẫu: nếu sử dụng trong ngày bảo quản ở tủ lạnh 4^oC, nếu để qua đêm hoặc thời gian dài thì bảo quản ở tủ -20^oC

- Mẫu máu bảo quản trong  ống chống đông EDTA

- Đối với DNA sau khi tách chiết xong phải sử dụng luôn nếu không phải bảo quản ngay trong tủ lạnh 4^oC.

- Đối với đối chứng dương P+ của kit: bảo quản ở tủ lạnh 4^oC, nếu sử dụng ngay sau khi hoàn nguyên để 5 phút để chất phân rã. 

- DNA nếu lưu lại mẫu và sử dụng cho lần sau cần bảo quản tủ -20^oC (6 tháng), ARN phải bảo quản -80^oC (6 tháng) trường hợp không có tủ -80^oC thì bảo quản ở tủ -20^oC (1 tháng)

Cách lấy mẫu

- Hút máu tĩnh mạch trên heo và bảo quản trong ống chống đông

- Gà: Lấy que lấy mẫu dịch swab khí quản của gà và cho vào ống eppendorf 1,5ml chứa 500ml PBS. Mổ khám lấy mẫu mô, nơi mầm bệnh khu trú nhiều nhất (tùy vào từng bệnh)

Chuẩn bị master mix

Kit iiQ-POCKIT:

- 1 bộ kit gồm 48 test, dạng đông khô, để bảo quản và vận chuyển dễ dàng tránh bị biến tính

- Chuẩn bị: hoàn nguyên Kit bằng dung dịch buffer premix đã có sẵn.

Hút 50µl dung dịch buffer premix cho vào kit, votex nhẹ rồi ly tâm (votex: trong  vòng 5-8s, nhẹ chậm và tránh bọt khí)

Chuẩn bị ống PCR trong phòng master mix

Chuẩn bị Kit vào trong ống PCR: hút 23µl dung dịch kit + 2µl DNA đã tách chiết.

Pha chuẩn dương: mỗi bộ kit có một chuẩn dương, hệ số 104, pha loãng 10 lần, lấy 27µl dung dịch tARN + 3µl chuẩn dương.

Mỗi bộ Kit chỉ cần làm đường chuẩn 1 lần.

Đọc kết quả

FAM và VIC cho kit iiQ-POCKIT cho quá trình chạy PCR

FAM là kết quả chạy chẩn đoán của mẫu, VIC là kết quả chạy đối chứng nội chuẩn

Hiệu quả phản ứng: 95% ~ 105%

Slope (Độ dốc): -3,1 ~> -3,6

Y (cq)= a.(log₁₀^slope/_ml)+b

Y là số ct or cq (số chu kỳ phản ứng bắt đầu), a là  b là

R² >= 95%